CONGELACIÓN DE SEMEN EN CANINOS

CONGELACIÓN DE SEMEN EN CANINOS

UBA Universidad de Ciencia Veterinarias
Julio 2009
En la presente revisión se tratan los aspectos más importantes de la evolución y desarrollo de la criopreservación de semen en el perro. Se realiza también la evaluación de los alcances de la inseminación artificial con semen criopreservado en esta especie.

INTRODUCCION
Si bien en otras especies, como por ejemplo en el bovino, la congelación de semen está extensamente estudiada y es una práctica de uso rutinario en muchos países, en el canino no ocurre lo mismo, encontrándose en pleno desarrollo y siendo su uso poco habitual.
En los países desarrollados la inseminación artificial (IA) con semen congelado en caninos es aplicada cada vez más frecuentemente debido a las posibilidades que ofrece. Sin embargo en nuestro país no se ha implementado, a pesar de la creciente demanda por parte de criadores.
Desde el primer nacimiento de una camada obtenida a partir de IA con semen congelado en 1969 (47), el interés demostrado por especialistas en reproducción y criadores estimuló el estudio sobre el área, dando como resultado la creación de bancos de semen en universidades y entidades privadas en diferentes lugares del mundo (11 , 34). Estos bancos de semen proveen un reservorio de material genético de suma importancia en la preservación de caracteres fenotípicos de diversas razas, previniendo cualquier posibilidad de desaparición futura, tanto por motivos ecológicos, sanitarios o catástrofes naturales.
Por otro lado la congelación de semen permite el uso de un reproductor luego de haber finalizado su vida reproductiva, optimizando su aprovechamiento. También es posible inseminar una hembra ubicada en una localización geográfica distante al hábitat del macho evitando las complicaciones y gastos que puede ocasionar el traslado de los animales (18). Por último, los conocimientos en la congelación de semen caninos pueden ser útiles en la congelación de semen de cánidos silvestres en vías de extinción lo que permitirá aumentar las posibilidades de preservación de estas especies (12, 13, 20).

Evolución y desarrollo de la congelación de semen en canino
Ya en 1776 Lázzaro Spalanzani había observado que el frío disminuía la tasa metabólica de los espermatozoides y permitía conservarlos (40). Con el paso del tiempo, esta observación posibilitó la refrigeración de semen, conservándolo durante cortos períodos de tiempo (2-4 días) con aceptable capacidad fecundante. En cerdos este método es utilizado en centros de Inseminación Artificial, para comercializar dosis inseminantes con establecimientos cercanos.
En porcinos El MRA® es un diluyente de uso corriente, que posibilita buena conservación del semen tanto en la viabilidad espermática como en la preservación de la capacidad fecundante (39). En caninos el diluyente en base a Tris y yema de huevo de gallina (TYH) es utilizado con resultados aceptables y permite utilizar semen refrigerado a 4 ºC y 15 ºC. con buena capacidad fecundante durante 24-48 horas posrefrigeración (44, 52). Este diluyente se ha comparado in vitro con diluyentes en base a leche y yema de huevo, y crema de leche y yema de huevo, obteniéndose resultados similares en cuanto a la conservación de motilidad espermática e integridad de membrana (44). Así mismo se han logrado mantener parámetros seminales posrefrigeración superiores a los obtenidos con TYH usando MRAâ tanto a 4 ºC como a 15 ºC (52).
La implementación de refrigeración de semen con diluyentes protectores como TYH en nuestro país, permitirá conservar espermatozoides con buena capacidad fecundante por un período de tiempo suficiente para trasladar el semen e inseminar animales ubicados en localizaciones geográficas distantes. Esto hará posible la IA de una hembra con el semen de un macho que se encuentre en otra provincia u otro país limítrofe o cercano con mínimo gasto y baja complejidad de manejo. De esta manera se ampliarán las posibilidades de uso de un reproductor, permitiendo la comercialización de semen y facilitando el intercambio genético entre diferentes establecimientos.
Dentro de las biotecnologías disponibles en caninos, la inseminación artificial (IA) es una de las más importantes para implementar el mejoramiento genético animal. Sin embargo no se trata de un método nuevo, ya en 1787 fue dea por Lazzaro Spalanzani quien usó semen fresco. La IA canina puede realizarse usando diversas técnicas de inseminación y variados métodos de conservación seminal.
Hasta hace poco tiempo se practicaba IA exclusivamente con semen fresco. Posteriormente se comenzó a utilizar semen refrigerado, y más tarde semen congelado. Al usar semen descongelado, se observó una baja fertilidad con inseminaciones intravaginales, con mayor éxito en la aplicación de la IA intrauterina transcervical o quirúrgica (laparoscopía, laparotomía) (10, 11, 31, 58, 59). Los resultados de preñez obtenidos son muy diversos variando entre un 40% y un 70% (35, 36, 48, 49, 16). Estos resultados tan dispares, se deben a diversos factores relacionados tanto con la calidad del semen utilizado, como con el momento de la inseminación (momento el ciclo estral de la hembra) y la técnica de IA empleada (15, 19, 23, 24, 53, 50, 55).
Es bien conocido el daño producido sobre los espermatozoides por las bajas temperaturas a las que son sometidos en el proceso de criopreservación (57). Las alteraciones físicas y químicas que se producen en la membrana celular del espermatozoide debidas a las modificaciones térmicas durante el enfriamiento y/o descongelamiento pueden comprometer parcial o totalmente la fertilidad (22). Los cambios más evidentes resultan en la pérdida de la motilidad espermática, así como pérdida de integridad acrosómica, lesiones que poseen gran correlación con el daño producido por el congelado y descongelado (8, 21, 38, 42, 43). Múltiples factores afectan la integridad de las membranas del espermatozoide. Los más importantes están relacionados con las condiciones físico-químicas de los diluyentes, los métodos de congelación, y los métodos de descongelación. Estos dos últimos afectan principalmente al sistema de membranas celulares, causando alteracionesultraestructurales, bioquímicas y funcionales en una proporción significativa. (6, 9, 28). Los cambios de las membranas serían similares a los de la capacitación y reacción acrosomal del espermatozoide (34,38).
Múltiples factores relacionados con los procesos de refrigerado, congelado y descongelado determinan el logro de una criopreservación satisfactoria. La utilización de procedimientos de dilución y refrigerado, elección correcta del buffer y crioprotectores, tiempo suficiente de equilibrio, curvas apropiadas de congelado y descongelado que produzcan mínimo daño de la membrana espermática y una mayor sobrevida de los espermatozoides en el tracto genital femenino, permitirán lograr mayores tasas de preñez. La conservación de la integridad estructural y de la fisiología espermática forma parte de los factores que permiten lograr altos porcentajes de preñez y camadas de mayor número de cachorros (24, 30).
Existen diversos trabajos sobre constitución de diluyentes, curvas y métodos de congelación y descongelación así como uso de diferentes crioprotectores (9, 13, 22, 34, 47). Se han formulado distintos diluyentes, sobre la base teórica de un buen amortiguador de pH (Tris–ácido cítrico), un energético capaz de atravesar la membrana plasmática (fructosa, glucosa), macromoléculas protectoras de membranas (lipoproteínas de yema de huevo, proteínas de la leche, glicoproteínas), crioprotectores penetrantes de membrana (glicerol, etilenglicol, sorbitol, manitol, inositol, DMSO, prolina, taurina, y otros), azúcares no permeables a través de la membrana plasmática, los cuales crean un medio hipertónico y consecuente deshidratación celular (lactosa, sacarosa, trealosa, rafinosa), moléculas hidrofílicas (proteínas nucleadoras de hielo, dextrano, proteínas anticongelantes), antioxidantes (catalasas, superóxido dismutasa) (2, 3, 6).
Los azúcares de alto peso molecular actúan a través de un mecanismo osmótico promoviendo la deshidratación celular durante la congelación e impidiendo la formación de grandes cristales de hielo dentro de la célula (56). Se ha comprobado el efecto benéfico de la incorporación de trealosa en diluyentes utilizados para la congelación de semen ovino (1, 32). Se han logrado buenos resultados con el agregado de 7,6% de trealosa al diluyente base, obteniéndose un 64% de motilidad progresiva al descongelado, superando el obtenido utilizando el mismo diluyente base sin el agregado del azúcar (1). Pocos estudios han sido realizados en relación a la incorporación de disacáridos a diluyentes utilizados para criopreservación de semen en caninos (15, 33, 54).
Los detergentes solubilizan y alteran las membranas celulares y sus componentes. Los del grupo alquil-iónico, al cual pertenece el dodecil sulfato iónico (DSI) desnaturalizan la estructura nativa de las proteínas de membrana y las disocian en sus cadenas polipeptídicas. Se ha utilizado la incorporación de DSI en diluyentes para criopreservación de semen canino (40, 51), observándose un efecto positivo sobre la supervivencia al descongelado y la integridad acrosómica. Rota y col. (45) incorporaron Equex STM (compuesto que contiene DSI) a un diluyente en base a Tris para la criopreservación de semen canino, obteniendo buenos resultados. Stornelli y col estudiaron el efecto producido por diferentes concentraciones de Equex STM sobre la supervivencia espermática al descongelado encontrando que la adición de 1,5% de este compuesto permitía obtener mejores índices de descongelación que cantidades inferiores (51).
La evaluación in vitro de la calidad de dosis descongeladas, permite estimar la eficacia de un diluyente para preservar a los espermatozoides de la agresiones a las que son sometidos en los procesos de congelación. Sin embargo, sólo una prueba de fertilidad a campo permitiría evaluar si los cambios realizados en la constitución de un diluyente mejorarán la criopreservación del eyaculado, permitiendo conservar un alto porcentaje de espermatozoides con capacidad fecundante y lograr así altas tasas de preñez y buen tamaño de camada.

CONCLUSIONES
La utilización de diluyentes que permitan conservar el semen canino a 4 ºC logrando altos porcentajes de espermatozoides vivos con motilidad progresiva e integridad acrosómica durante 2 a 5 días hará posible el traslado de semen a diferentes puntos de nuestro país e incluso a países limítrofes o cercanos. Esto evitará el traslado de animales para la realización de servicio natural disminuyendo los costos y esfuerzo que esto implica. Es importante destacar que el proceso de refrigeración de semen canino es de bajo costo y fácil realización, pudiendo implementarse con mínimo equipamiento y moderado entrenamiento del operador. Por otro lado el semen refrigerado puede utilizarse realizando inseminación artificial (IA) intravaginal, técnica poco costosa y de baja complejidad. Es así que la implementación de técnicas de refrigeración de semen e inseminación artificial con semen refrigerado en nuestro país permitirá a los Médicos Veterinarios de práctica privada brindar un nuevo servicio, aumentar sus ingresos y mejorar su práctica diaria.
Por otra parte la congelación de semen canino aplicando metodologías que permitan obtener porcentajes aceptables de espermatozoides viables al descongelado hará posible introducir esta biotecnología en nuestro medio. Si bien el proceso de congelación de semen canino requiere un moderado costo, equipamiento, infraestructura y entrenamiento del operador, su utilización mediante IA puede ser aplicada en la práctica diaria mediante el uso de técnicas de IA intrauterinas sencillas (IA quirúrgica) que no requieren mas entrenamiento que el necesario para realizar una ovariectomía, práctica de rutina en el ejercicio profesional.